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커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 525(2023) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

혈관 내피 세포(EC)는 혈액과 조직 사이의 동적 경계면을 형성하고 혈관 염증의 진행에 중요한 역할을 합니다. 여기서 우리는 염증성 내피 사이토카인 반응의 시스템 전반에 걸친 분자 메커니즘을 분석하는 것을 목표로 합니다. 편견 없는 사이토카인 라이브러리를 적용하여 우리는 TNFα와 IFNγ가 가장 큰 EC 반응을 유도하여 뚜렷한 단백질체 염증 시그니처를 초래한다는 것을 확인했습니다. 특히, 결합된 TNFα + IFNγ 자극은 추가적인 시너지 염증 특징을 유도했습니다. 우리는 (포스포-) 프로테옴, 전사체 및 분비체를 결합하여 이러한 염증 상태를 분석하기 위해 다중 오믹스 접근법을 사용했으며 자극에 따라 보체 단백질, MHC 복합체 및 별개의 것을 포함하여 변경된 면역 조절 과정의 광범위한 배열을 발견했습니다. 분비 사이토카인. 시너지 효과로 인해 전사체 유도가 협력적으로 활성화되었습니다. 이 자료는 내피 염증의 기초가 되는 복잡한 분자 메커니즘을 설명하고 숙주 방어 및 혈관 염증에서 내피의 적응성 면역 조절 역할을 지원합니다.

내피 세포(EC)는 혈관 내부에 늘어서 있으며 혈액과 주변 조직 사이에 역동적인 경계면을 형성합니다. 산소, 영양소 및 노폐물 교환을 촉진하는 것 외에도 EC는 1차 지혈 중에 혈소판을 끌어당겨 혈관벽의 틈을 봉쇄함으로써 지혈을 제어합니다1. 더욱이, EC는 염증 동안 조직 안팎으로 면역 세포가 이동하는 것을 제어하는 중요한 문지기입니다. 이 적응 시냅스에서의 역할을 위해 EC는 기계적 스트레스, 호르몬(예: 바소프레신, 히스타민), 세포(예: 호중구, 단핵구, 혈소판) 및 기타 외부 자극(예: 트롬빈)과 같은 환경 신호를 감지할 수 있는 장비를 잘 갖추고 있습니다. , 사이토카인)2,3,4,5. 면역 세포의 이동 외에도 EC는 항원 제시 및 사이토카인 분비와 같은 여러 가지 면역 조절 능력을 가지고 있습니다. 그러나 EC는 이러한 면역 조절 특성을 갖고 있으며 병원체와 접촉하는 최초의 세포 중 하나이지만 면역 세포 네트워크에서는 거의 언급되지 않습니다7,8,9.

EC 항상성의 조절 완화는 내피 세포의 과도한 염증 또는 과응고 상태를 초래할 수 있습니다. 이러한 내피 기능 장애는 수혈 관련 급성 폐 손상, 패혈증, 류마티스 관절염, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 안구 혈관병증, 만성 신장 질환 및 코로나1910을 포함한 여러 다면적인 염증성 질환과 관련이 있습니다. 14,15,16,17,18,19.

내피 항상성과 사이토카인 모두 이러한 질병에서 규제가 완화되었지만 적응성 내피-사이토카인 상호 작용을 조율하는 분자 기반은 대부분 종양 괴사 인자-알파(TNFα)에 대한 연구로 제한됩니다. 더욱이, TNFα와 인터페론-감마(IFNy)와 같은 사이토카인 사이의 상승작용은 EC에서 관찰되었으며 염증성 장애에 해로운 영향을 미치는 것으로 나타났습니다20,21,22,23. 기본 메커니즘이 제안되었지만 시스템 전반의 EC 응답은 특성화되지 않았습니다.

따라서 이 연구에서 우리는 내피 콜로니 형성 세포라고도 알려진 혈액 성장 내피 세포(BOEC)를 광범위하고 강력한 확장으로 인해 EC의 소스로 사용하여 내피 사이토카인 반응의 분자 특징을 분석하기 시작했습니다. 성숙한 혈관 EC 마커의 발현 및 성인 기증자로부터 분리되는 능력.

우리는 EC가 수용체 레퍼토리를 표현하여 다양한 사이토카인 신호를 촉진한다는 것을 보여줍니다. 그러나 편견 없는 사이토카인 라이브러리로 자극하면 TNFα와 IFNγ에 대해 주로 독특한 염증 상태가 관찰되었습니다. 더욱이, TNFα와 IFNγ의 결합된 자극은 상승적인 EC 반응을 초래했습니다. 여러 오믹스 수준을 결합하여 우리는 신호 전달(포스포프로테옴)에서 mRNA 전사(전사체), 단백질 조절(프로테옴) 및 단백질 분비(분비)에 이르기까지 이러한 염증 상태의 분자 기반을 분석했습니다. 이 연구는 시스템 전반에 걸친 적응성 EC 염증 상태를 밝혀 염증 발병에서 EC-사이토카인 상호 작용의 역할을 강조하고 염증의 적응형 플레이어로서 EC를 반복합니다.

5). b Cytoscape interaction network of receptors and potential ligands (red dots: receptors, yellow dots: ligands, purple dots: proteins fulfilling both receptor and ligand criteria), edges represent STRING-DB scores. Inserts show zooms of example cytokine-receptor interactions; for network with labels, see Supplementary Fig. 1b./p> 1). b Summarizing network of differentially abundant proteins between stimuli. Node labels show cytokine stimuli. Node size represents amount of statistically significant proteins. Edges show overlap between proteomes, color intensities (white to black) of edges indicate amount of overlapping proteins as a ratio of the smaller node. See Supplementary Fig. 3 for non-summarized network. c Profile plots of modules describing cytokine proteomic responses with cytokine annotation. Gradient scale indicated z-scores of median LFQ-score of genes in a module per stimulus, Yellow: cytokines related to an increased abundance response profile; purple: cytokine(s) related to a decreased protein abundance response, cytokines which contribute to the module regulation are highlighted. Replicates have been summarized to medians for visualization, modules are indicated by color, M1 (pink), M2 (blue), M3 (green), M4 (red) and M5 (yellow). d Proteins with high modules membership scores plotted as median label-free intensities (LFQ). e Enriched GO terms and Wikipathways per module. MF molecular function, CC cellular component, BP biological process./p> 1). d LFQ intensities of hallmark proteins per stimulation./p> 1). c Area plots of cumulative temporal dynamics of changes in the phosphoproteome (teal areas and solid lines), transcriptome (brown area and dotted lines) and proteome (purple areas and dashed lines). d Tile plot of the top enriched GO terms per stimulation: IFNγ (pink), TNFα (orange), TNFα + IFNγ (green) and omics level (as indicated). Color gradient indicated –log10 BH-adjusted p values. MF molecular function, CC cellular component, BP biological process. e Line plots of phosphorylation events, transcript levels and relative protein abundances of members of highly enriched GO:terms. Circles indicate medians; error bars show standard deviations (n = 3 biological replicates)./p>0.95) interactions. This resulted in a network containing 2306 interactions, revealing 9 high-density hubs summarized in biological processes: "Viral sensors", "Cytokines", "Complement factors", "JAK/STAT signaling", "Cell cycle", "NFKB signaling", "Proteasome", "NFKB complex" and "Antigen presentation" (Fig. 5d and Supplementary Fig. 6). Plotting the ratio of response classifications per hub, only two were majorly TNFα induced: NF-κB complex proteins (47% TNFα) and cytokines (44% TNFα), while all others were primarily IFNγ-induced. Especially the hubs, "Complement factors", "Viral sensors", "Proteasome" and "Antigen presentation" were predominantly IFNγ-induced (>75%). None of the hubs were majorly synergistically induced, suggesting synergy is confined to specific proteins and not entire biological processes./p>5-fold) (Fig. 6b). C3, crucial in the activation of the alternative pathway, is the only uniquely TNFα-induced transcript in this hub. However, whether transcript expression translated to protein increases is unclear as corresponding proteins were not detected. IFNγ also induced a strong antigen-presenting hub (Fig. 6c). We previously reported TNFα induces MHCI proteins, including HLA-A, HLA-B and HLA-C, which we observed here too36. However, these MHCI complex proteins as well as immunoproteasome (PSMB8, PSMB9 and PSMB10) and immunoproteasome regulator subunits (PSME1 and PSME2), peptide loading proteins (TAP1, TAP2, ERAP1 and ERAP2)37,38 and immune checkpoint protein Programmed death- ligand 1 (CD274) were higher induced by IFNγ compared to TNFα. Moreover, IFNγ also induced MHCII complexes required for exogenous antigen presentation. HLA-DR, HLA-DQ and HLA-DP transcripts were upregulated 4–7-fold at 12–24 h of IFNγ stimulation. Interestingly, in contrast to MHCI proteins, which were detected abundantly on the protein level, we were only able to detect HLA-DRA and HLA-DRB in separate LFQ workflow experiments (Supplementary Fig. 7a). To visualize the discrepancy between MHCI and MHCII protein expression, we stained BOECs for HLA-A/B/C or HLA-DR after stimulation of TNFα, IFNγ or combined stimulation. MHCI showed a clear distribution over the cell membrane, also in steady-state condition (Supplementary Fig. 7b) and in line with both transcriptome and protein data, HLA-DR was only observed in IFNγ stimulated conditions. However, in contrast to the membrane distribution of HLA-A/B/C, HLA-DR was mostly localized to compartments inside the cell (Fig. 6d)./p> 1). Colors indicate stimulus: TNFα (green), IFNγ (blue), TNFα + IFNγ (red). c Interaction network of differentially regulated proteins after 24 h TNFα + IFNγ stimulation showing protein type per hub indicated in gray. d Heatmap of enriched proteins in the cytokine registry per omics level showing correlating transcripts and proteins in lysate after TNFα, IFNγ and TNFα + IFNγ stimulation. Color gradient indicates z-scores. Several proteins are highlighted in line plots showing VST and LFQ values, error bars show standard deviation (n = 3 biological replicates). e Number of papers enriching for cell type interactions by cytokines induced per stimulation. Node size represents number of papers, per stimulus largest node is set to most cited cell type (TNFα: n citations = 566, IFNγ: n = 140, TNFα + IFNγ: n = 153)./p>95% in the total proteome./p>1./p> 1 was considered significant and relevant. For label-free secretomics data, a BH-adjusted p < 0.01 and log2 fold change > 1 was used as the significance threshold./p>0.4) were selected and annotated for Uniprot "secreted" and "signal" keywords or GO:CC "extracellular space" and "extracellular region" terms to define receptor ligands. Connections between receptors and ligands were visualized in Cytoscape 3.8.0./p>0.7 with TNFα and <0.7 with IFNγ stimulation); S2-IFNγ shape (correlation coefficient <0.7 with TNFα and >0.7 with IFNγ stimulation); S3-common shape (correlation coefficient >0.7 with TNFα and >0.7 with IFNγ stimulation) or S4-TNFα + IFNγ shape (correlation coefficient <0.3 with TNFα and <0.3 with IFNγ stimulation). Effect sizes were categorized as E1-TNFα effect (AUC ratios TNFα + IFNγ stimulation/TNFα stimulation <2 and TNFα + IFNγ stimulation/IFNγ stimulation >2); E2-IFNγ effect (AUC ratios TNFα + IFNγ stimulation/TNFα stimulation >2 and TNFα + IFNγ stimulation/IFNγ stimulation <2), and E3-TNFα + IFNγ effect (AUC ratios TNFα + IFNγ stimulation/TNFα stimulation >2 and TNFα + IFNγ stimulation/IFNγ stimulation >2). Classifications were set to common if S3 but not E3 criteria were fulfilled; TNFα classification: S1 or S3 + E1; IFNγ classification: S2 or S3 + E2; TNFα + IFNγ classification: S3 or E3 classifications were fulfilled. If not fulfilling any shape or effect size cutoffs, classification was set to "not classified"./p>0.9 gene names were connected with edges. Edges between phosphosites, corresponding proteins and transcript were manually appended to the network. This network was visualized in Cytoscape 3.8.0. We first obtained the "EdgeBetweenness" using the "Analyse Network" function, after which we used "Edge-weighted Spring Embedded Layout" to visualize the network. We highlighted interaction hubs based on closeness of nodes, overall regulation levels and biological overlap./p>

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